CRISPR/Cas系统，你不了解的那些事儿

CRISPR/Cas系统是一种高效的基因编辑工具，被广泛应用于基因编辑、基因治疗及核酸检测等领域。CRISPR/Cas系统由CRISPR基因座、Cas效应蛋白及向导RNA组成，有着强大的家族体系，成员主要分为两类，第1类（第I、III、IV型）利用多种Cas效应蛋白，而第2类（第II、V、VI型）则需要单一的Cas效应蛋白。其中颇受关注的Cas9（II型）、Cas12a（V型）和Cas13a（VI 型 ）系统有很大的区别（见图1-2）。

应用较早的CRISPR/Cas9系统，是通过利用sgRNA（由crRNA和tracrRNA 组成）特异性识别靶序列，引导Cas9核酸内切酶对靶序列的PAM上游3 位核苷酸外侧进行切割，造成靶位点DNA双链断裂来发挥编辑作用的，其靶基因为dsDNA，切割类型为平末端，大小为1,000-1,600个氨基酸，被广泛用于哺乳动物的基因编辑^[1]。

与之相比，CRISPR/Cas12a（即Cpf1）系统只需要crRNA引导，体积小，只有1,200-1,300个氨基酸，切割位点远离识别位点，并形成粘性末端，更易递送至细胞内，实现基因组连续多次和更加精准地编辑。通过在crRNA的引导下识别含PAM的靶DNA，靶DNA解链后，靶标链与crRNA形成Rloop（RNA-DNA杂合链），释放出Cas12a中RuvC的活性位点；非靶标链被RuvC切割，使靶标DNA解旋，接着靶DNA的靶标链也被RuvC切割；当完成顺式切割后，若有ssDNA进入，都会被RuvC反式切割，其反式切割活性已应用于高灵敏度核酸检测中，对疾病的检测与诊断发挥重要作用^[2-3]。

较上述两种系统，CRISPR/Cas13a系统中Cas13a体积最小，约930个氨基酸，而且靶基因为RNA，首先crRNA识别靶RNA，结合形成双链RNA。导致Cas13a与crRNA的构象变化，使两个HEPN结构域（切割活性区域）逐渐靠近，成功激活Cas13a蛋白的RNA酶切活性，其中Cas13蛋白不仅能切割靶RNA，还能切割游离的任意单链RNA。处于一种酶促“激活”状态，这种特性在限制疾病传染，缩小感染范围有很大潜能^[4]。

综上，三种系统在向导RNA、PAM、目标基因的类型等方面均存在差异，目前应用相对广泛的是Cas9，而Cas12a和Cas13a由于体积较小，作用目标基因不同等特性，影响力也在逐步提升，加之越来越多的效应蛋白被发掘，CRISPR系统终将在基因编辑、疾病诊断等领域大放光彩。

参考文献

[1] Doudna, Jennifer A , Charpentier, et al. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9[J]. Science, 2014, 346(6213): 1258096.

[2] 周晨晨, 刘写写, 谢海华. CRISPR家族新成员: CRISPR-Cpf1^*[J]. 生物化学与生物物理进展, 2018, 45(6): 585-592.

[3] Bayat H, Modarressi M H, Rahimpour A. The conspicuity of CRISPR-Cpf1 system as a significant breakthrough in genome editing. Current Microbiology, 2018, 75 (1): 107 - 115.

[4] Akshay T , Alexandra E S , Knott G J , et al. RNA Binding and HEPN-Nuclease Activation Are Decoupled in CRISPR-Cas13a[J].Cell Reports, 2018, 24(4):1025.