载体构建方法之Gateway克隆方法

要说怎么实现载体构建自由，那非Gateway克隆方法莫属，克隆效率高达95％或更高。把您感兴趣的基因构建到Gateway入门克隆，您就可以实现在多种表达系统（原核，酵母，昆虫，哺乳动物等）中自由分析您的蛋白。

原理

Gateway克隆技术是一个高效的大规模克隆系统。该技术利用人噬菌体的位点特异性重组(人噬菌体用此重组系统进行裂解途径和溶原途径之间的互相转换)，实现了不需要传统酶切连接过程的基因快速克隆和载体间平行转移，同时保持正确的阅读框和方向。

操作步骤

1. BP反应：目的基因与供体载体连接，形成入门克隆。

通过PCR将attB位点添加到目的DNA序列两侧，形成attB-PCR产物。用attB-PCR产物或者含attB位点的供体质粒（Donor Vector）和含attP位点的质粒发生重组生成入门克隆(Entry Clone)。

2. LR反应：带有attL位点的入门克隆与带有attR位点的目的载体（Destination Vector）发生LR反应，目的基因从入门克隆重组到目的载体，形成表达克隆（Expression Clone）。

在完成BP反应和LR反应之后，下一步就是和其他载体构建方法一样的转化、阳性克隆筛选。

入门克隆和目的载体携带不同的抗生素标记，可通过使用抗生素选择出表达克隆。进行重组反应时需要使用对CcdB敏感的大肠杆菌菌株，如DH5α、TOP10、Mach1-T1。

特点

优点：相对于传统的限制性酶切克隆，省去了传统酶切方法中克隆冗长的制造黏性末端与纯化步骤，反应过程中自连率低、重组率高，同时适合于大片段基因的克隆表达，具有快速、高效、不依赖限制酶，将片段转移到多个载体系统中，以进行蛋白质表达和功能分析等优势。

缺点：该方法不能直接使用PCR产物，需要先构建入门克隆；不能无缝克隆，留下至少25 bp的疤痕序列；不易进行多片段克隆；试剂盒价格昂贵，成本较高。

每种载体构建方法都有各自的优缺点，那载体构建有没有完美解决手段呢？当然有，那就是基因合成。基因合成是用人工方法合成基因的技术，是基因获取的手段之一，也相对于从已有生物中获取基因来说，基因合成无需模板，因而不受基因来源限制。当遇到载体构建不顺利和以下实验需求建议选择基因合成：1.基因合成可获得自然界中无法以常规实验手段得到的基因。 2.基因合成因其可以人为设计和操控，研究人员可设计创造自然界中不存在的基因序列为生命科学领域的发展开辟了全新的途径。 3.基因合成可以实现对已知基因序列进行密码子优化或者氨基酸序列突变，以达到对该基因进行高效表达或获得新的生物特性等研究目的。 4.基因合成特定基因库，通过一定的筛选方法，筛出感兴趣的蛋白分子，如表达抗体库。 5.合成生物学通过基因合成大量的基因，或代谢通路的一系列基因，甚至整条的人工构建染色体。 6.其它需要特定序列的DNA的情形，如IVD的阳性对照模板以及其它工艺开发中的不同碱基组成的已知模板、较长的特定的探针库、转录mRNA或其它RNA的模板质粒等。