二代测序常见问题
随着测序技术飞速发展，测序手段层出不穷，逐渐成为科研利器，第二代DNA测序技术又称为下一代测序技术（Next-generation sequencing，NGS），是目前应用最广泛的测序手段之一，下面我们通过一些常见问题逐渐深入了解二代测序。
1. 什么样本可以做NGS测序分析？
答：NGS实验不挑样本，动物、植物、微生物等具有遗传信息的物种都可进行NGS测序实验分析，但需要根据自己的实验设计和需求来选择测序样本类型和检测项目。
2. 我们进行分析时使用的参考基因组是怎么来的？
答：通过Denovo测序（也就是从头测序）得到数据，然后拼接得到基因组序列，再通过不断的完善和功能注释即可使用。
3. 什么是重测序（Resequencing）？
答：重测序是指待测物种的基因组已经测序或发表，即已有参考基因组，现在对其重新测序。以首次测序的结果为参考，通过对新测序reads进行短序列比对，得到测序结果。简而言之就是对基因组序列已知的物种个体进行基因组重新测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。
4. 什么是测序深度，与基因覆盖度是一回事吗?
答：测序深度（Sequencing Depth）是指：测序得到的碱基总量（bp）与基因组（转录组或测序目标区域大小）的比值，是评价测序量的指标之一。例如：人类全基因组大约3G，测序深度30X的话，即获得3×30=90G的数据量；覆盖度（Coverage）是指测序获得的序列占整个基因组的比例。由于基因组中的高GC、重复序列等复杂结构的存在，测序最终拼接组装获得的序列往往无法覆盖所有的区域，这部分未覆盖的区域就称为Gap。
5. 重测序要求测序深度，是越多越好吗？大约多少X合适？
答：测序深度（Sequencing Depth，SD）是评价测序量的指标之一，是测序得到的碱基总量与基因组大小之比，或者说是基因组中每个碱基被测序到的平均次数（假如1个基因组大小为1G，测序深度为10X，则总数据量为10G）。一般来说测序深度越多越好，不过测序深度越多，芯片要求也会越高，成本越高，测序错误率或假阳性结果会随之有所下降，因此通常有参物种推荐10-30X，根据分析需求不同，选择合适的深度测序(SNP/InDel >10X，SV > 20X，CNV > 30X, 转座子> 20X)，增加测序深度可以提高基因组覆盖度和变异检出率。
